液相&液质的峰“丢了”可咋办？
有没有遇到过这样的情况，正走这样品呢，色谱峰不见了，有没有很着急，更让人抓狂的是你还不知道哪里出了问题。此时感觉哪哪都可疑，但看上去哪哪也都挺正常，心中除了凌乱还是凌乱，不要怕，排查引起不出峰的诸多因素，小析姐和你一起找回那个不听话的“色谱峰”!
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查看压力线
对于液相色谱来说，压力是一个非常重要的参数，它对于我们判断液相是否运行正常来说具有十分重要的意义!采集软件大都具有记录样品运行时的实时压力曲线的功能，当我们怀疑液相某模块有问题而导致不出峰时，我们往往可以将之前“正常出峰”时的样品和此时“不出峰”时的样品压力线调出来做一个对比，从中我们可能发现重要的线索!
正常情况下，相同方法走出来的两针样品，它们的压力线(形状、大小、波动情况等)应该是几乎重叠的，如果不重叠，再结合不出峰的现象，我们归纳出三类不正常的压力线：
(1)压力线大致形状相同波动正常但整体降低
如下图所示，“正常出峰”和“不出峰”样品压力线大致形状相同，波动正常但压力线在进样时有明显的下降，此种压力线导致不出峰的现象多由泄漏造成，但进样器泄漏仪器往往不会报错因而不易察觉，此外，进样器泄漏往往会导致样品部分或完全无法进入液相系统从而造成不出峰;
为进一步验证进样器是否存在泄漏，我们可以通过切换进样器的六通阀来做简单的判断!首先，我们应搞清楚进样器主路(Mainpass)和旁路(Bypass)的概念，当进样器处于主路时，来自泵的液体从六通阀1号位进入，2号位出来，然后经过计量泵、定量环、针和针座进入到六通阀5号位，然后从6号位出来进到柱温箱;
当进样器处于旁路时，来自泵的液体从六通阀1号位进入，6号位直接出来到柱温箱，因此，我们可以得出结论：进样器在主路时由于经过的部件较多，所以进样器处于主路时的压力理论上应该比旁路时的高;
明白了上面的道理，我们就可以通过下面三步对进样器进行验证：
① 首先我们可以通过增大流速或者使用粒径更小的色谱柱等方式将系统的压力调整至比您平时做样时最高压力高50Bar左右的水平(但不可超过液相系统及色谱柱的耐压值)，然后等待压力线平衡;
② 切换进样阀，如果Mainpass压力比Bypass压力高一些的话，如下图所示，那么证明您的进样系统不会有太大的泄漏(如果旁路比主路压力低的过大，则有可能是针或者针座等堵，可根据主路旁路图思考一下为什么);
③ 切换进样阀，如果Mainpass压力与Bypass压力持平或更低，这就意味着你的进样器可能存在泄漏，需要采取措施;
进样器的泄漏多发生在针座、六通阀转子密封圈、定量环等位置，遇到这种问题多数需要工程师上门更换备件解决，如果动手能力比较强且有相应备件的老师们可自行更换排查。
自己动手更换进样针、针座及定量环。整个过程一共分为6个步骤，千万按照顺序来做，不要随意跳步骤。希望大家耐心学习。
自动更换进样针、针座及定量环
1、配置Lab Advisor软件，并使用Lab Advisor配置进样器进入维护模式。
开始之前的准备工作如下：
(1)在Masshunter采集软件中将所有模块Standby，并关闭采集软件;
(2)使用Remove MassHunter软件，清除软件后台程序;
(3)然后打开Lab Adviso软件，建立和液相之间的连接，并操作Lab Advisor使进样器进入维护。
具体操作步骤如下：
2、拆下Safety Cover和Wash Port。
G7129X进样器进入维护模式后，才可以拆下安全盖(Safety Cover)，拆下安全盖之后进样针，定量环就能一览无遗了。但是要维护还太早，别忘了要把洗针槽转到维护位置才可以。
具体操作步骤如下：
3、拆下定量环，进样针，针座(注意更换顺序是先拆定量环，然后进样针，最后针座;安装的顺序相反。)
如果您仅需要更换定量环，则可以跳过拆进样针，跳过拆针座，跳过安装针座，跳过安装进样针。
如果您仅需要更换进样针，则需要拆下定量环，需要拆下进样针，可以跳过拆针座，跳过装针座。
以此类推
具体操作步骤如下：
4、安装针座，进样针，针座
安装的过程和拆卸相反，顺序是先安装针座，再安装进样针，最后是定量环。
具体操作步骤如下：
注：不管拆装了任何部件，都必须认真执行第5步的调整进样针位置，切记!
5、调整进样针的位置
由于前序操作会略微改变进样针的角度，位置。然而小于1mm的偏差就可能造成进样针不能精准的扎进针座中心的小孔中。所以不管前面4个步骤您做了什么事情，第5步都不能忽略，这点很重要。
具体操作步骤如下：
6、退出维护模式，结束维护过程
这是最后一个步骤，将Wash port放回正常位置，盖上Safety Cover，并在Lab Advisor中退出维护模式。
具体操作步骤如下：
(2)压力线波动异常并伴随整体降
如下图所示，“正常出峰”和“不出峰”样品压力线大致形状相同但压力线波动异常且压力线存在明显的降低，此现象一般多由液相压力异常波动导致，压力异常波动往往伴随着液相系统输液比例或者流速不准，甚至是无流动相输送等情况，如此一来，必将导致样品在液相流路或色谱柱中滞留从而造成不出峰或者出峰时间漂移等现象;
引起压力异常波动的情况有许许多多。具体都要哪些因素呢?
压力波动的具体因素排查
首相，如何查看压力线
如果你正在仪器前正襟危坐准备进样，那么可以通过调取在线压力实时监控图进行观察，如果压力线一马平川，毫无波澜，那么你大可放心运行序列，然后泡杯咖啡静静等待分析结果!
如果你的样品已走完，发现保留时间凌乱的一塌糊涂，你又严重怀疑是压力波动引起的，那么你可以通过定性软件提取离线压力曲线对运行过的样品压力线进行查看(其他软件如Chemstation等也有相应的查看方法)。
那么，什么叫压力波动?顾名思义压力波动就是压力曲线超出正常范围，有规律或无规律地上下波动，这里我们要区别于压力异常(包含压力异常升高，压力异常降低，平行样品压力曲线不重合等等)，话不多说，下面我们从五个方面来讨论讨论引起压力波动的种种因素，并给出相应的应对策略!
1、检查溶剂类型设置
无论是几元泵都有溶剂类型需要设置，错误的设置会导致不正常的压力波动!
其实溶剂类型的设置和溶剂的压缩因子有关，我们知道每一种溶剂都有可压缩性，这就会造成泵头在输送液体时产生误差，因此我们要让泵头做出一个补偿，针对不同的溶剂要做出不同的补偿。
四元泵溶剂类型设置：
二元泵溶剂类型设置：
2、排查流动相因素
流动相往往是我们最容易忽略，也是我们最容易排查的因素，我们首先要检查是否用错流动相?流动相是否放置时间过长?(水相中是否长藻?乙腈是否发生聚合?)如有必要请重新配置流动相!
更换新鲜流动相后，打开purge阀，将流速设为5ml/min，充分purge后(至少5 min以上)，关闭purge阀，观察压力线是否正常~
当更换新鲜流动相后，这时我们可先purge或者prime各路流动相至少5 min以上，如果压力依然波动，可conditioning 至少15min以上然后观察压力曲线。
四元泵 Prepare Pump：
二元泵 Prepare Pump：
3、排查溶剂过滤头因素
溶剂过滤头是流动相进入液相的第一道关卡，日积月累里面藏污纳垢在所难免，在排除了流动相因素之后我们不妨看看是不是因为溶剂过滤头堵了才导致了压力波动!
为验证这个问题，我们可以暂时将溶剂过滤头从溶剂管线中去除，purge流动相一段时间，排出管路中的气泡，然后观察压力曲线是否恢复正常，如果压力恢复正常，那我们要好好呵护一下我们的溶剂过滤头啦!啥?如何呵护?
最简单粗暴的方法，全部换成新的~!
对于玻璃滤头，我们建议将其浸泡在35%硝酸中浸泡约1h后，用干净的水将其彻底冲洗干净，切记不可对其进行超声清洗(超声会将滤头内部的滤孔超碎，滤头失去过滤作用)!
对于不锈钢滤头，我们建议将其放入干净的水中超声清洗，不可对其用硝酸浸泡(酸液会将金属腐蚀)!
4、排查脱气机因素
流动相没毛病，purge了N久也不行啊，滤头卸了压力也还是波动，可咋整?别急，我们再看看脱气机工作正不正常!
红色框框中的就是脱气机了，那么，怎么判断它正不正常呢?
检查红色区域周围是否有液体泄露的痕迹(例如缓冲盐溶液泄露后，干掉的痕迹)，如果存在明显的泄露痕迹那么有可能是脱气机内部的真空腔漏了~!
如果脱气机外面没有明显漏液痕迹，那么我们可以利用气泡法来进一步检验脱气机：提起溶剂入口管线，放几段小气泡至溶剂管线中，以5 ml/min的流速purge流动相，如果气泡经过脱气机后明显变小或消失，则证明脱气机工作正常，反之，如果气泡经过脱气机前后毫无变化，那说明脱气机脱气效率已经很差了~!
如果气泡测试也正常，我们还可以更进一步验证脱气机：以一定的流速单走甲醇相观察压力是否稳定(最好接柱子)，然后走甲醇和水混合相观察压力是否稳定，若单走甲醇相压力稳定，走甲醇和水混合相压力波动则脱气机还是有故障~!
脱气机的故障导致的压力波动一般多出现在四元泵，四元泵两相一般在低压条件下混合，如果溶剂脱气效率不足，混合后就会导致压力波动，有关于脱气机故障!
5、排查泵头因素
先要判断是哪个泵头有故障导致的压力波动再采取有效措施，方法很简单：将AB两通道入口管线都放在甲醇流动相中，充分purge两相后(最好接柱子)，单走A相观察压力是否正常，然后再单走B相观察压力是否正常，产生压力波动那相的泵头可能有问题哟~~(若是经验丰富的老师还可以通过Lab Advisor诊断工具，对泵头进行判断!)
一般主动阀阀芯引起压力波动的现象比较常见，主动阀阀芯主要由弹簧、红宝石球及球座构成，若是球座磨损或者有脏东西附着在宝石球与球座上就会造成泵抽取液体时入口阀关不紧，造成压力波动~!
因此，我们可以将主动阀阀芯拆出来放入水中或有机溶剂中超声或者直接更换来解决此问题。
(3)压力线形状明显不同但波动正常
如下图所示，“正常出峰”和“不出峰”样品压力线形状明显不同但压力波动正常，此现象多由流动相比例失调导致;
首先应该检查是否用错流动相(最好重新配置新鲜流动相以彻底排除流动相因素)，其次，如果您是带比例阀的四元泵液相系统，我们还要对比例阀进行“堵”和“漏”的排查，比例阀的堵塞和泄漏往往会导致液相系统输液比例的失调(例如有机相的比例减少)，从而造成一些化合物无法从色谱柱中洗脱出来，导致不出峰或者出峰时间漂移等情况;
如遇上述问题，我们可以分两步走：
① 首先我们按下图步骤操作，排查比例阀是否存在内漏;
如果按照上图一顿操作之后，观察到如下图所示的位置有液体持续流出，那证明比例阀内部存在泄漏，此时只能找工程师上门帮忙解决了。
② 如果经过上面的测试，并没有液体持续流出，那证明比例阀不存在大的内漏，此时我们可以用水/异丙醇溶液反复冲洗比例阀，以此来排除比例阀存在的堵塞情况，具体操作步骤如下：
将ABCD四通道溶剂入口管线都置于异丙醇/水溶液中(50:50)，将每个通道比例都设为25%，流速设为5 ml/min，purge阀打开，冲洗15min以上，然后进样查看出峰是否正常;
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样品影响
如果经过“正常出峰”和“不出峰”样品压力线的对比，发现它们几乎重叠且无任何异常，那我们接下来就要重点排查一下是否是进样因素导致了不出峰;
(1)检查样品是否变质
对于样品变质因素导致的不出峰，我们可以通过重新配置新鲜样品(最好为浓度较高的标准品)和进其他样品的方式来判断是样品本身问题还是仪器问题导致的不出峰，若进新鲜样品或者进其他样品都出峰正常，则重点怀疑原来的样品变质!
(2)检查样品在样品瓶中液面是否过低
如下图所示，我们一般建议样品在样品瓶中的液面位置能在1.0-1.5 ml的刻度，如果样品量过低(低于0.5 ml位置)，则有极大可能进样针吸不到样品，从而造成不出峰的现象;
那么，有的老师会问了，我的样品极其稀有或难以制备，无法任性地在样品瓶中加那么多可咋整?教你两种方法轻松解决：
① 可如下图所示在样品瓶中加装内插管(使用内插管时，切忌使用瓶底感应功能);
② 可在如下图所示软件中的位置调低进样针进样时的吸样位置(使用此功能时，切忌使用瓶底感应功能);
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色谱柱影响
如果排查了进样因素，依然不出峰，那么我们可以再对色谱柱进行进一步的排查，首先我们可以将色谱柱去掉，换成一个两通(如下图所示)，然后进一针样品，查看是否出峰正常;
PS：若您的方法为质谱dMRM方法请先将其改为MRM方法后再进样测试，进样完成后提取各化合物的色谱图，查看是否有响应。
若接两通出峰，接柱子不出峰，那说明色谱柱(或者预柱)可能有问题了，小编曾经遇到过色谱柱问题导致多种农残化合物检测时，某几种化合物不出峰的现象，此时，建议：
1、过夜冲洗色谱柱(纯水+纯有机相);
2、更换新色谱柱和预柱;
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检测器的影响
检测器是最终产生色谱峰信号的地方，如果检测器出了问题，那么很容易会造成不出峰的现象;
(1)若您的检测器是紫外检测器(VWD、DAD)
① 检查氘灯的使用时长(一般氘灯寿命在2000小时)，并查看灯能量测试是否能够通过，若不通过请更换氘灯;
② 检查波长校准测试是否能够通过，若不通过，请对波长进行校准;
(2)若您的检测器是质谱(三重四级杆)
首先我们建议您对质谱进行一次“检验调谐”，通过检验调谐结果来判别质谱是否存在问题，如果检验调谐不通过，我们还可以对质谱进行“自动调谐”!
此时您的内心肯定会有三个疑问，检验调谐如何判别是否通过?如何看懂检验调谐及自动调谐报告?自动调谐不通过怎么办?
调谐报告怎么看
1、基本参数与界面
新版本软件的Autotune和Checktune的报告开头都会详细记录调谐质谱的基本情况，包括调谐时的真空读数和离子源参数。同时Autotune报告还提供了质谱的其他参数，我们一般会关注EMV的电压值。
Autotune报告中还会提供如下的MS Scan(扫描图)和Profile(轮廓图)。我们可以从中看出离子强度的分布规律，以及调谐液有没有污染(在Manual tune中会详细描述这两种图的意义)。注意：Autotune中的离子图都是在快要生成报告的时候某一时刻的截图，虽然不会像Manual tune那样可以查看实时图，但每一份调谐报告都是调谐状态的重要记录。
(2)两个重要的delta
这两个delta的数值直接决定了Checktune是否pass。Autotune报告中没有这两个delta的原因是使得这两个delta达到要求是Autotune的目的之一。
第一个delta指的是实测m/z和目标m/z的差值，也就是质量准确度，一般小于0.2即认为正常;
第二个delta指的是实测FWHM(Full Width At Half Maxima，即半峰宽)和目标FWHM的差值，也就是分辨率，一般unit是和0.7的差值在0.14之内、wide是和1.2差值在0.6之内、widest是和2.5差值在1.25之内。
(3)让人纠结的Adjust
Checktune的报告显示黄色的Adjust无疑是最让人揪心的，尤其是零星的Adjust，到底要不要管它，是不是一定要“报告上下全是绿呢”?我们要正确的看待Adjust，简单来说，如果你做样的目标物的m/z落入的调谐离子区间内都是Pass那就可以正常做样。
看下图，1521和2121这两个离子的质量轴都偏掉了，但922及其之前的都是OK的，那么意味着如果你的目标物的m/z范围都是在922以下，那么我们大可不用管它，可以直接做样，不会有什么影响。
而下图显示的118,322,622都处于Adjust，因为低端质量我们应用面很广，所以这种情况下一般建议进行调谐。
还有一种情况就是unit一切OK，但wide或widest很糟糕，这种情况下如果你的方法中只使用了Unit，那么没有问题，可以直接做样。
(4)都是绿色的pass就意味着质谱是OK的吗?
答案当然是否定的。我们还需要看Abundance，也就是调谐离子的响应，响应并没有固定指标去评价。所以即便响应下降很多倍(如从300K下降到30K)，但只要质量准确度和FWHM都是pass，Checktune报告就是一片绿色(pass)，但此时的机器显然并不正常。
不同型号机器的离子强度会有较大的差异，包括本机的离子强度也会和各种因素相关，所以判断离子强度并没有绝对的依据，而是更凭经验。所以判断离子强度需要持续观察，累积经验。一般整体响应和本机之前的调谐中的响应作对比，只要下降不是很多就可认为正常。
第一种常见的响应强度问题是所有离子的强度都偏低。造成这种现象的原因可能会有很多种，一般会建议先维护一下离子源和喷针，再去进行一次Autotune或者手动调谐EM电压。
第二种常见的强度问题是典型的毛细管故障。如下图所示，118和322的高度明显偏低，大概率就是毛细管出问题了。毛细管是通往质谱内部的第一条”道路”，里面若有污染，首要影响的就是低端质量的离子，所以这种低端响应低，高端响应正常，且MS1 MS2都如此的Checktune报告会把问题指向毛细管。
第三种常见强度问题是调谐液污染。其中一种情况是322.05这个离子的响应很低，而且此时往往意味着Autotune即使能调过，也可能会由于调谐液的污染造成某些参数的偏差，此时的Autotune报告中的Scan图也可能会显示出322附近的离子像是“消失”了一样。这个时候就必须要更换好的调谐液重新进行调谐了。
最后需要说明的是，上述三种强度问题也同样适用结果中有显示adjust的时候。
如何进行手动调谐
自动调谐虽然简单，但耗时较长，当遇到问题需要诊断或者想要快速进行质量轴、峰宽调节的时候就需要用到手动调谐(Manualtune)来大显身手。因此掌握Manual tune是成为质谱调谐高手的重要一步，它可以大大的减少在调谐上花费的时间。进入Manual tune界面后，需要首先将左上角的calibration on起来，然后再点击右边的Acquire按键来获取质谱图。
手动调谐具有如下优点：
具有全部的检查调谐(Checktune)的功能。
具有一部分自动调谐(Autotune)的功能：包括调整质量轴，设定EM电压的功能。
熟练掌握之后可以在很短的时间里初步判断仪器的状态。
注：既然Autotune这么好，那我闲着没事就做一下，实际上这是没有必要的。只要你的调谐离子的质量准确度OK，响应也没有下降很多，样品也响应正常，那么Autotune的意义不大。包括关机开机后，很多人也往往有Autotune的习惯，但这并不是必须要做的。如果你觉得质谱有问题，或者重新开机过夜抽真空后，都可以进行检验调谐(Checktune)。顾名思义，Checktune并不会改变任何参数，仅仅是去验证一下调谐离子的表现是否正常，如果check出来有很大的问题，那就可能需要Autotune了。
质谱检验调谐通过，或者后来做的自动调谐通过后，进样品测试，还是不出峰，内心接近崩溃怎么办?不要慌，我们最后再来检查一下质谱的流路切换阀是否发生内漏导致样品流到废液或其他地方而没有进入质谱导致不出峰了!
方法很简单，如下图所示，将液相至质谱的管线从质谱入口处断开，将其直接接在雾化器上，进样测试，看是否出峰，如果出峰正常，那说明质谱的流路切换阀有问题。
好了，现在按照以上步骤操作，看看你能找回丢失了的色谱峰吗?
(内容来源：安捷伦 网络 由小析姐整理编辑)
