方法验证内容
验证内容包括方法的确证性、正确度、精密度、检测限、定量限、线性关系、耐变性和系统适用性等。具体包括仪器仪器参数、试剂、系统适用性试验、供试品溶液制备、对照品溶液制备、测定、计算等。
方法验证的实施
1确证性
确证性系指在分析样品中可能有共存物质(如食物基质、其他成分、降解物等)情况下，采用的分析方法能够正确鉴别、测定被分析物质。如果分析方法的确证性有缺陷，可以用其他方法加以补充。如色谱法测定结果可用质谱或分子光谱加以确证等。确证性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，需确证含被分析物的试样呈阳性，而不含被测成分的试样为阴性，结构相似或组分中的有
关化合物也应呈阴性。
2准确度
准确度系指分析方法所得测定值的偏离程度，通常以测定值的总平均值与真值之间的差来表示。如果有相应的标准物质，准确度可以测定室内重现精度时所得总平均值与真
值的差表示。如果没有相应的标准物质，准确度可以加标回收率进行表示，但需要指出的是加标回收率有时并不能准确反映出方法真实的准确度。
对于评估一个方法而言，对于一个有真值样品的检测结果可以确定一个方法的准确度，而针对一个方法的加标回收率就相对难以单纯用数值进行判断，因为不同含量水平、不同物质其加标回收率结果的要求是不同的(见表3-1)。对于一些复杂基质中痕量物质的检测，建议尽可能使用内标法。
准确度的结果与试样的含量水平有着密切的关系，应全面根据试样的含量水平判定准确度结果的可靠性。进行加标实验时要根据试样的含量水平进行至少3个水平的添加实验。一般对于禁用物质应在方法的检测限、两倍方法检测限和十倍检测限进行三水平试验;对于已制定最高残留限量(MRL)的物质应在方法检测限、MRL、通常含量水平处进行三水平试验;对于未制定MRL的物质应在方法检测限、常见限量指标、通常含量水平处进行三水平试验。
3精密度
精密度是指从均匀样品中抽取的试样进行重复分析测定时，所得到的一系列测定数据彼此之间的一致程度。测定值的误差以偏差、标准偏差或相对标准偏差的形式表示。根据重复实验的不同可采用平行样的相对相差、多对样品的相对偏差和室内再现偏差来表示。平行样的相对相差和多对样品的相对偏差系指实验室、实验者、实验日期、装置、器具以及试剂的批号等实验条件均未改变的情况下，从均匀样品中抽取的两个以上复数个试样短时间内进行重复分析测定时的测定结果。室内再现偏差系指同一实验室内，实验者、实验日期、装置、器具以及试剂的批号等实验条件一部分或全部改变的情况下，从均匀样品中抽取的复数个供试品进行重复分析测定时(室内再现条件)的偏差。为了正确得出分析方法的精密度，必须有足够的实验次数、分析条件的水平
数。并且要对可预想到的致使分析发生变化的要因进行研究。将其与分析方法所要求精度的标准值进行对照，以确定分析方法是否可行。特别要注意的是实验时要保证所用试样的数量和均匀性。溶液应为均匀性样品，在得不到均匀性试样时，通常将大量试样粉碎混合，并在通过适当的均匀性
评估后使用。否则可能会出现由于实验问题导致精密度不符合要求的现象。一般对于禁用物质应在方法的检测限、两倍方法检测限和十倍检测限进行三水平试验。对于已制定最高残留限量(MRL)的物质应在方法检测限、MRL、通常含量水平处进行三水平试验。对于未制定MRL的物质应在方法检测限、常见限量指标、常见含量水平处进行三水平试验。一般要求至少重复测定6次。
4检出限
为某特定分析方法在给定的置信度内可从样品中检出待测物质的最小浓度或最小量。所谓“检出”是指定性检出，即判定样品中存有浓度高于空白的待测物质。该指标能够用来表示仪器本身的性能。检出限除了与分析中所用试剂、仪器设备等有关外，还与仪器的稳定性及噪声水平有关。方法的检出限与分析空白值、精密度、灵敏度密切相关，是分析方法的一个综合性的重要计量参数。光谱检出限可以通过空白样品或检出限附近的样品测定值的标准偏差以及
检出限界附近的标准曲线的斜率算出。
DL=3×σ/slope……………………(1)
式中：DL——检出限
σ——空白样品测定值的标准偏差
slope——检出限界附近标准曲线的斜率
应用色谱法时，测定值的标准偏差可以用信噪比代替。
5定量限
定量限是指样品中所含的被测物质可被进行定量的最小量或最低浓度。通常定量限可以通过空白样品或被测物定量限界附近的样品测定值的标准偏差以及定量限界附近的标准曲线的斜率算出。例如，根据定量限附近的标准曲线的斜率以及空白样品测定值的标准偏差，由下式(2)求出定量限。
DL=10×σ/slope……………………(2)
式中：DL——定量限
σ——空白样品测定值的标准偏差
slope——定量限附近标准曲线的斜率
应用色谱法时，测定值的标准偏差可以用信噪比代替。
分析方法的定量限理论上应比限量标准中规定值要低一个数量级以上。
6线性关系
线性关系是指分析方法能够得到与被测物质的量或浓度具有线性的测定值的能力。线性范围是指具有一定精度和准确度的被测物质上限及下限量(浓度)之间的数值范围。具有线性关系的分析方法系指具有一定精度和准确度，并且使线性关系成立的被测物质上下限量(浓度)之间的领域。该指标对于判定结果是否准确还是非常重要的，如果超过线性范围结果是否可靠有待进一步研究。最佳测定范围应小于方法的适应范围，对测量结果的精密度(通常以相对标准偏差表示)要求越高，相应的最佳测定范围越小。通常好的分析方法要有宽的线性范围。有的分析方法线性范围只有一个数量级，有的分析方法线性范围可达5～6个数量级。
通常，至少采用5个不同量(浓度)的样品作线性关系的研究。校准曲线包括标准曲线和加标工作曲线，前者用标准溶液系列直接测量，没有经过预处理过程，这对于样品往往造成较大误差;而后者所使用的标准溶液经过与样品相同的消解、净化、测量等全过程或在净化处理后阴性样品中添加标准。凡应用校准曲线的分析方法，都是在样品测得信号值后，从校准曲线上查得其含量(或浓度)。因此，绘制准确的校准曲线，直接影响到样品分析结果的准确与否。此外，校准曲线也确定了方法的测定范围。校准曲线绘制时对于标准溶液一般可直接测定，但如试样的预处理较复杂致使污染或损失不可忽略时，应和试样同样处理后再测定。校准曲线的斜率常随环境温度、试剂批号和贮存时间等实验条件的改变而变动。因此，在测定试样的同时，绘制校准曲线最为理想，否则应在测定试样的同时，平行测定零浓度和中等浓度标准溶液各两份，取均值与原校准曲线上的相应点核对，其相对差值根据方法精密度不得大于5%～10%，否则应重新绘制校准曲线。校准曲线的线性检验原则上要求其相关系数|γ|≥0.9990，否则应找出原因并加以纠正，重新绘制合格
的校准曲线。在线性检验合格的基础上，对其进行线性回归，如校准曲线的回归方程计算结果准确度不高，应找出原因予以校正后，重新绘制校准曲线并经线性检验合格。回归方程如不经检验和处理，就直接投入使用，必将对测定结果造成
偏差。斜率检验即检验分析方法的灵敏度，方法灵敏度是随实验条件的变化而改变的。在完全相同的分析条件下，仅由于操作中的随机误差导致的斜率变化不应超出一定的允许范围，此范围因分析方法的精度不同而异。例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相对差值小于5%，而原子吸收分光光度法则要求其相对差值小于10%等。
7耐变性
系指将分析条件在小范围内变化时，测定值不受影响的能力。例如，分析中的样品性质、pH值、温度、所用试剂品种及使用量、人员等分析条件在适当的范围内改变时，对测定值的稳定性进行的研究结果。其中，试样性质是需要重点考虑的内容之一，任何一种方法都有其试样适应范围，能否针对某种试样采用该分析方法需要经过严格的验证，技术参数符合要求时方可采用，并形成相应的报告。不同的色谱柱、试剂批号和牌号之间存在着一定的差别，这些差别可能直接会影响到结果的准确与否，因此当改变上述内容时均需要进行验证性实验并形成相应的报告。对于色谱柱还应确定拖尾因子、分离度、容量因子、塔板数等指标。
由于监测技术机构所处区域不同，因此温湿度条件存在较大差异，为此推荐的方法必须根据监测地的气候条件进行验证试验，即使是同一地点的不同季节之间也应对方法进行验证试验，以保证方法的可用性。每个监测实验室均应具备一套针对监测项目的标准物质，并有相应的证书。当购买或使用他人配制的标准溶液时需要确定其含量是否准确，并应有相应的保存要求和使用期限。人员改变对于分析方法可能会造成结果的变化，为使不同人员检测结果尽可能一致就需要在改变人员时，对该人员进行方法验证，直到其能够准确得到检测结果时该名检验人员方可从事此项工作。
8空白试验
当空白实验出现干扰时需要逐一分析查找污染产生的原因并明确其控制措施。当由于是环境原因造成的干扰时建议改变实验场所，以避免出现干扰;如果是非环境原因造成的，则需要对分析中使用的各种试剂以及实验器具、仪器设备甚至对实验者本人进行污染原因的查找，直至这些因素消除。如果出现恒定的、不可消除的因素时可采取扣除空白值的方法。
